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微制造方法已广泛用于控制微米级的局部细胞环境。然而，准确地模拟体内的复杂性在同一基质上共培养多种类型的细胞时，在保持形式和设计自由的同时保持组织结构仍然是一个挑战。浦项科技大学相关课题组在“Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing”（发表于《Scientific Reports》）的研究中首次提出了一种按需喷墨打印方法，可将活细胞直接图案化到细胞友好的液体环境中。通过细胞喷射和撞击行为的高速成像精确优化打印参数，实现细胞位置的高分辨率控制。该课题组通过将不同的细胞共同打印成各种设计，包括复杂的梯度排列，展示了直接细胞打印方法的能力。最后，课题组通过在培养基填充的培养皿中生成以不同大小的棋盘图案打印的A549和HeLa细胞，应用该技术来研究细胞群的异质性和几何形状对季节性H1N1流感病毒 （PR8）感染性的影响。直接喷墨细胞图案化可以成为基础生物学和应用生物技术的强大而通用的工具。

研究团队将载有细胞的墨水喷墨打印到充满细胞培养基的细胞培养皿的预定位置上 （图 1a）。使用带有xy移动台和z轴升降喷头的压电喷墨打印系统（Jetlab® II，MicroFab Inc.）制造复杂的细胞图案。作为墨水，活细胞以6×106个细胞mL-1的密度悬浮在细胞培养基中。在打印之前评估了充满细胞的墨水的剪切粘度。细胞通过一个直径为80μm的喷头 (MJ-ATP-01 80, Microfab Inc.) 从储墨器中打印出来，并注入一池液体介质中以进行图案化。活细胞通过多个步骤排列在预定的图案上（图 1b）。首先，使用施加的压电信号输入从喷墨喷头的尖端喷射载有细胞的液滴。在单次闪光图像中捕获液滴形成的阶段（图 1c）。接下来，将排出的细胞放入培养皿中的培养基中（图 1d）。当液滴与液体介质聚结时形成涡环。涡流在大约1毫秒内迅速传播到液体中，并随着速度变慢而变得更宽。初始渗透深度为~167µm，然后细胞以~14.2µm s-1的速度缓慢分散到液体中，直到它们到达培养皿底部（图 1e）。随着时间的推移，细胞粘附在印有图案的培养皿底部。

▲ 图1  直接喷墨单元打印系统和工艺。（a）使用3轴可控压电喷墨打印系统进行直接喷墨单元图案化的装置示意图。(b) 在充满液体的板中对细胞进行图案化的过程的示意图。（c）使用 CCD 相机和火花闪光灯以30微秒的间隔获得充满细胞的液滴喷射的高速频闪图像。( d) 液滴撞击充满液体的基材后下沉细胞的高速电影图像。( e ) 在不同的时间间隔跟踪下沉细胞的位移。

接下来，研究团队使用3种不同的检测方法检查了细胞活力和增殖：在细胞打印后立即使用LIVE/DEAD检测试剂盒进行即时测量，跟踪细胞增殖率1周，以及长期检查维持培养物中的细胞形态3周。LIVE/DEAD测定的结果显示打印组和移液对照组之间的即时存活率差异可忽略不计（图 2a）。打印组和对照组的存活率分别为98.6%和99.0%。一周后，打印组的细胞密切遵循移液对照组的生长曲线，F=0.06485。在双向方差分析中，组间没有观察到显著差异（p>0.05）（图 2b））。此外，由于打印细胞的增殖，在第7天观察到的打印细胞增殖高于对照组。在打印后获得的细胞图像中，细胞保持其形态并存活3周，代表8代（图 2c）。没有观察到染色体断裂或细胞损伤的明显迹象。

▲ 图2  印后细胞活力测试。( a ) LIVE/DEAD测定用于测量打印后立即的细胞存活率。( b ) 每隔一天测量增殖率，持续7天。（c）监测长期细胞形态直至第8代。比例尺：50μm。

研究团队使用直接喷墨打印工艺对NIH3T3和HEK293A细胞的各种设计进行图案化。首先，图 3a显示了印在细胞培养皿上的迁移测定模型，用于跟踪和量化伤口愈合或药物反应测定中的细胞行为。NIH3T3细胞以受控密度进行图案化，留下0.5和1mm的空间。每天捕获图像以显示随时间推移由细胞增殖和迁移引起的间隙闭合。接下来，NIH3T3细胞用3种不同的荧光染料，红色、绿色和蓝色（RGB）标记，并进行图案化以证明异型细胞图案化的可能性（图 3b-e）。细胞被打印成足够精细的图案，以显示弯曲的设计和不同颜色组的边缘边界之间的区别。在验证使用RGB标记的细胞制造异型共培养模型的可能性后，使用不同的细胞系打印了真正的异型共培养模型（图 3f）。NIH3T3小鼠成纤维细胞和HEK293A人肾细胞被共同图案化到具有锯齿形界面的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。锯齿形图案的边界清晰可见，因为含有NIH3T3细胞的区域似乎比含有HEK293A细胞的区域明显更暗。

▲ 图3  直接打印到培养基中的各种细胞图案的演示。（a）具有1mm和0.5mm间隙的打印细胞迁移测定模型。比例尺：500µm。（b-e）红色、绿色和蓝色标记的细胞图案的荧光图像。比例尺：1mm。（f）使用NIH3T3和HEK293A细胞的异型共培养模型打印的锯齿形图案。比例尺：1mm。

除了高分辨率图案外，直接细胞打印的另一个优点是它能够通过改变液滴密度来引入细胞浓度梯度。研究团队通过简单地打印3种RGB标记的细胞墨水来绘制包含7种彩虹色、 青色和洋红色的9种主要颜色的颜色图表，以显示在浓度梯度中对细胞进行图案化的能力（图 4a）。根据从所需的9种颜色获得的预设RGB颜色比率，将细胞图案化为9个切片方块。例如，第一行中心的橙色是通过分别以5:2:0的比例打印3个RGB标记的单元格而着色的。这一策略举例说明了一步控制单个培养皿中的细胞密度和图案。在仅使用3个彩色单元格验证了杂色表达之后，研究团队尝试模仿Georges Seura的杰作“埃菲尔铁塔”。他们在介质中打印了RGB标记的细胞，通过使用并列的微小彩色点来对绘画进行图案化，类似于这位法国后印象派画家使用的方法（图 4b）。细胞密度梯度的有效控制和其喷墨打印方法的高分辨率在“埃菲尔铁塔”打印中创造了一个渐进和连续的细胞分类。对细胞密度的局部控制使我们能够在类似的印象中可视化和模仿原始特征。

▲ 图4  使用直接喷墨细胞打印的密度控制2D单元格图案。( a ) 九色图表打印有用红色、绿色、蓝色 (RGB) 染料标记的单元格。比例尺：1mm。( b ) Georges Seurat 的“埃菲尔铁塔”用标记有3种颜色染料的细胞进行了图案化。比例尺：1mm。

这里开发的直接打印方法在液体环境中生成了多种类型细胞的自由形式图案。活细胞的受控空间位置是通过将悬浮在小瓶中的活细胞通过按需喷墨喷头输送到培养基填充的培养皿中而创建的，而不会引起损坏。这种方法可能为更准确地模拟在活生物体中观察到的关键细胞 - 细胞和组织 - 组织界面提供新的机会。此外，该技术可应用于高通量分析和药物筛选。

参考文献：

[1] Park J A ,  Yoon S ,  Kwon J , et al. Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):1669.