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在丝状支架上喷墨打印自组装肽以进行神经元细胞的图像化处理

发布时间:2021-07-12
发布人:RUIDU

制造支架来引导神经元细胞的生长是一个挑战,细胞图像化处理是一项重要的技术,它能帮助研究人员准确地将细胞群定位到基底上的指定区域,并促进复杂生物系统的设计,以研究细胞行为如细胞排列、细胞间相互作用、细胞与环境相互作用及药物筛选等应用。因此,一种能够快速制造有图案的支架/底物的技术是必不可少的。谢菲尔德大学招秀伯教授课题组在“Patterning the neuronal cells via inkjet printing of self-assembled peptides on silk scaffolds”(发表于《Progress In Natural Science:materials International》)的研究中,采用自组装I3QGK肽纳米纤维通过旋转涂层和喷墨打印的方法将其覆在带负电荷的RSF膜上以引导细胞附着,然后将大鼠嗜铬细胞瘤神经元(PC12)细胞作为神经元分化和神经突起形成的体外模型,研究了图案化表面上PC12细胞的细胞附着、活力和表型。

实验材料主要为家蚕茧(西南大学)、合成肽AC-I3QGK-NH2(GL Biochem)、PC12神经元细胞来源于HPA培养物及其他化学试剂。蚕茧通过洗涤、煮沸冲洗流程后去除丝胶,将脱胶后的丝素在60℃的烘箱中干燥2天后进行透析并离心得到RSF,将处理后的合成肽以及RSF通过旋涂设备涂覆在干净的玻片上,使用MicroFab Jetlab 4 XL系列喷墨打印设备,以90V、300Hz的电压参数喷墨打印直线及谢菲尔德大学标志,打印后进行细胞培养。


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▲ 图1  通过旋涂和喷墨打印在RSF基板上制造微图案,以及在图案表面附着细胞


经过细胞计数、染色实验及数据统计等测试步骤,可以得出,支架的表面形貌对细胞粘附有显著影响,为了建立支架表面形貌和细胞附着之间的关系,使用原子力显微镜来表征RSF/I3QGK的形貌,如图2。

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▲ 图2  不同表面及RSF/I3QGK比例的AFM图像


并且,研究表面细胞活性也与表面形貌以及RSF/I3QGK比例有关,如图三所示,总体来说,随着I3QGK浓度的增加,附着在表面的细胞数量也会增大,但是当I3QGK浓度增加到5mg/ml时,细胞数量略有减少(图3g),部分区域无细胞附着,这可能是由于当使用高浓度的肽溶液进行表面涂层时,堆叠的纳米纤维脱离(图2g),这意味着生物力学因素也起着重要作用,当表面有更多的肽纤维时,一些肽纤维在染色后的缓冲洗液中会发生黏结松散和脱落。由此可以假定RSF/I3QGK为神经元细胞的附着和增值提供了一个很好的解决方案,最好的涂层I3QGK浓度约为3-4mg/ml。


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▲ 图3  不同表面及RSF/I3QGK比例的细胞活性

神经元细胞对齐在轴突再生中起着至关重要的作用,是神经组织工程的一个关键方面,Inkjet打印是一种新兴的技术,可以以非接触方式用于生物材料的微观图案制备,因此本研究中被用于在RSF涂层基底上绘制肽纳米纤维图案,如谢菲尔德大学的标志(图4),随着打印层数的增加,附着的细胞数量也会增加,说明PC12细胞在RSF/I3QGK上的增值与附着取决于附在表面的纳米肽纤维的数量,细胞的排列在细胞分化、细胞微环境和细胞与细胞相互作用中起着主导地位。

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▲ 图4  通过Inkjet制备肽纳米的纤维谢菲尔德大学校徽

综上所述,合成肽I3QGK可以动态地自组装成纳米纤维,通过电荷作用将其涂覆或打印到RSF支架上,改善神经元细胞的附着和分化以及神经突的生长。此外RSF/I3QGK对PC12神经元细胞具有较低的细胞毒性,喷墨打印能够将功能性肽纳米纤维墨水沉积成复杂的图案,并促进组织工程应用中的细胞排列,为进一步分析体外细胞功能(如轴突发育)提供了一种方法。


参考文献:

[1] Sun W ,  Zhang Y ,  Gregory D A , et al. Patterning the neuronal cells via inkjet printing of self-assembled peptides on silk scaffolds[J]. Progress in Natural Science, 2020, 30(5).

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