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使用电喷雾技术高通量制备亚飞升级的体外分隔系统

发布时间:2021-06-15
发布人:RUIDU

随着微米纳米级设备的进步,在极其微型化的水滴隔室中封装生化反应,重新定义了化学和生物科学的实验设计。这种基于油包水微滴隔室的封装的关键作用,被称为体外隔室化(IVC)[2][3][4]。体外隔室化在试管环境中改变了自然选择的使用,而无需在每个蛋白质(表型)与其编码基因(基因型)之间建立绝对联系;这种连接一直是常规分子进化的主要要求,但通常是一个限制步骤。IVC的这种能力突出了这样一个事实,即它可以构成一个系统,为功能性生物分子[5] 的体外定向进化在概念上简单且“无偏差”提供一种捷径;

IVC的最新技术最初是基于使用涡旋和均质化对油包水液滴进行大量乳化而开发的。这些方法既简单又快速,但产量是不可预测的,并且在液滴尺寸方面表现出相当大的可变性,典型的直径范围从1到100μm,对应于反应体积也有fL到nL差异。这种多分散性可能导致进化中的分子潜在不均匀分布,这些分子在整个液滴群中的数量通常非常大(即数百万到千万亿),从而使精确和定量实验变得困难。此外,在均质过程中发生的剧烈混合往往会导致IVC中使用的酶的活性损失不可接受[6]。多分散性限制可以通过在具有精心设计的微流体几何形状的微通道中产生基本上单分散的液滴来克服。然而,基于微流体的系统有两个实质性的限制。一个限制是生产率低;即,一次产生一个液滴;该技术在产生非常小的液滴方面也受到限制。克服第一个限制的尝试包括使用几个连续的微流体模块或先进的微通道几何形状,允许以千至兆赫的频率连续形成液滴[7] [8][9]。然而,这些方法无法纳入进化分子工程中使用的大型进化分子库,因为这些库比微流体液滴数量的上限大几个数量级。还有一种使用石英或聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)微升/飞升室阵列微制造的方法,,但是再次在技术上限于较低吞吐量。更为重要的是,根据现阶段研究,体外基因表达系统的生产率与液滴的半径成反比[10][11],并且也强烈地受到在散装乳剂用于液滴产生的油/表面活性剂的性质的影响。因此,一种可以整合本体形成和微流体形成等传统乳化方法,以及单分散液滴的形成,是一个令人兴奋的前景,它可能允许超高通量产生高度单分散和极小型化的液滴可以在基于IVC的定向进化中维持相当数量的进化分子。

电喷雾是质谱中通常使用的一种电离技术,是一种成为产生散装单分散液滴的潜在手段。电喷雾是电场力作用于毛细管喷嘴出口处的液体表面,形成泰勒锥;当电场力超过表面张力时,射流会伸长成细丝,然后自发分裂成细小且相对单分散的液滴,这些液滴远小于孔口直径。这项技术已得到广泛认可,包括获得诺贝尔化学奖;然而,它在浸没模式下的使用仍然受到限制,主要是因为对分散流体浸入另一种不混溶液体时的现象缺乏了解[12]。油中液体的电分散可能是实现上述目标的一项有趣技术。值得注意的是,有研究文献说明,一种液体在另一种液体浴中的电分散比在空气中容易得多[13][14]。

在这项研究中,使用电流体动力学的打印平台,将浸入式电喷雾与IVC相结合,用于超快速生成油包水液滴。与传统方法(批量或微流体)相比,该平台能够改进尺寸和速度控制,并且允许大规模生产并行IVC。静电型喷墨喷嘴浸没在主体油相中;当施加电压时,该系统能够连续产生封装在亚飞升液滴中的生物分子。系统地研究了影响液滴尺寸和单分散性的参数,包括电压和频率、孔口直径尺寸和流体特性等电气参数。该研究生产的电分散的油包水液滴中封装了产生绿色荧光蛋白 (GFP) 和/或mCherry的无细胞基因表达系统。通过使用共聚焦荧光显微镜检查荧光强度来监测作为液滴大小函数的蛋白质表达率。

这项研究中,使用电流体动力学的打印平台,电喷雾模式来生成直径在亚微米范围内的单分散液滴射流。类似于电喷雾技术,导电液体通过带电的毛细管喷嘴缓慢注入。由于其表面张力,毛细管喷嘴内的液体达到半球形弯液面。在施加脉冲直流电压的情况下,由于弯月面区域附近的离子积累,会出现切向电应力。在特定的阈值电压下,会出现瑞利不稳定性现象,导致静电力与作用于水面的表面张力不平衡。这导致圆锥形状的形成,通常称为泰勒锥,从泰勒锥的尖端喷出细细的液体微丝,最终碎裂形成单分散液滴的喷雾。产生的液滴的大小与毛细管的直径无关,可以获得小于微米的液滴。该技术的基本实验装置描述如图1。通过细电极线连接到高压电源控制器单元的毛细管喷嘴浸入充满油/表面活性剂混合物的透明底部储液器(用于可视化)中。电场是通过从毛细管喷嘴施加高压产生的,由生物分子组成的液体通过喷嘴被挤出和喷射。如在示意性示出图1中,水包油毫微微规模隔室由单分散水性液滴,随后可以通过相互扩散的产生形成/表面活性剂的油滴混合物。实时和高速成像用于捕获射流的释放,该射流破碎成离散的液滴,相应的视频1中看到。激光扫描共聚焦显微镜用于对油包水液滴隔室进行成像。如图2a所示,液滴的平均尺寸是通过动态光散射计算的,当使用具有4微米孔口直径的喷嘴时,发现其尺寸为1.31微米。根据计算,使用该实验装置在单个脉冲中产生了55到108个液滴(图 1)。在1kHz的最大频率下,即每秒1000个脉冲,当前设置导致以接近每秒100000个的速率产生单分散水滴每秒液滴。通过使用更高频率生产率可以进一步提高大约2个数量级。 

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为了在这些微小的飞升液滴内进行定向分子进化,需要更换溶液或添加多个洗涤步骤以去除不需要的分子。然而,当使用带有油包水液滴的独立油层时,这些步骤可能会出现问题。最近,水凝胶基质(如琼脂糖)在液滴内的应用被广泛期待作为多步骤过程的基质支持,因为可以交换小分子,而凝胶基质保留更大和更理想的分子,如蛋白质。此外,与水中的无限制酶相比,载体(水凝胶)基质对酶活性的影响可能更明显[15]。当采用这种方法时,低熔点琼脂糖的使用赋予了灵活的溶胶-凝胶转换特性。因此,接下来研究团队评估了他们的系统生产单分散飞升油包水凝胶珠的能力,这是传统微流体工艺难以获得的。他们封装了超低胶凝琼脂糖,其熔点约为55°C,胶凝点低于15°C,在油包水滴内包裹荧光染料。如图2b所示,油包琼脂糖凝胶珠的平均尺寸是通过动态光散射计算的,当使用具有15微米孔口直径的喷嘴时,发现其尺寸为1.55微米。电喷雾后,生成的油包琼脂糖液滴在冷却(从37°C 到4°C)后转化为油包琼脂糖凝胶珠。

在典型的喷墨中,粘度和表面张力等参数是影响液滴尺寸的关键因素。因为他们使用带浸渍喷嘴的静电喷墨作为电喷雾方法,射流分解成不同大小的液滴主要受喷嘴大小、水相的表面张力、油相的粘度和各种仪器参数,包括电压供应、偏置和频率。首先,喷嘴的尺寸决定了泰勒锥的几何形状,根据喷嘴的孔口直径,可以在喷射喷雾中产生不同的模式(例如,锥形射流或振荡射流)。所以,图3a显示了2种不同喷嘴尺寸(4μm和65μm)的液滴尺寸分布,同时保持其他参数不变。大喷嘴提供大接口面积;因此,在外部电场的影响下,每个液滴在界面处受到不平衡应力,导致振荡喷射模式,导致更宽的液滴尺寸分布。相比之下,小喷嘴提供的界面面积较小,导致锥形喷射模式。因此,与较小的喷嘴相比,在较大喷嘴的情况下观察到多分散性。其次,射流的面积由发生喷雾的介质决定。因为空气提供的摩擦力可以忽略不计,喷墨打印在空气中产生液滴比在油的情况下更方便,其中粘性力(或摩擦力)在界面处施加剪切应力。然而,与空气相比,油介质增加了水滴的稳定性,产生卫星水滴的可能性较小。研究观察到平均液滴尺寸随着粘度的增加而增加,如图3b。此外,针对高温(90°C 5分钟)和储存时间(25°C 24小时)评估了生成的液滴的稳定性。没有观察到对液滴平均尺寸的显着影响。第三,很容易推测电压和频率对液滴尺寸分布的依赖性,因为当向液体施加电压时会发生电喷雾,并且施加电压的频率会影响作用在界面上的力。施加的偏置电压的增加会增加界面处的液体量,从而产生更大的液滴尺寸。与这种关系一致,当在100Hz的恒定频率下将偏置电压从100V增加到1000V时,研究团队观察到向更大液滴尺寸的转变。然而,在更高的频率下由于水相和油相界面处的干扰增加,电压会促使更小的液滴尺寸,这导致产生与较低频率相比更小的液滴。

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作为超细电喷雾用于IVC用途的证明,其中基因被分隔和表达,通过用PURE系统封装GFP编码基因作为无细胞基因表达系统,在飞升液滴内进行GFP合成在飞升液滴中。将带有PURE表达系统的GFP编码cDNA (35 nM) 置于4μm玻璃喷嘴中,使用电喷雾产生油包水液滴,然后在37°C下孵育2小时。如图4a所示,使用共聚焦显微镜成功监测了GFP荧光。因为在没有GFP-cDNA的情况下产生的液滴中检测到的荧光量可以忽略不计,所以很明显荧光是由于液滴内新合成的GFP的积累所致。图4a 中的荧光强度图清楚地描绘了对照(无模板)和样品(有模板)之间的差异。研究团队观察到GFP荧光的最小液滴直径为0.81μm,对应于0.3fL的体积。

图4:电喷雾产生的亚飞升油包水液滴中的体外蛋白质表达

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研究结果表明,静电喷墨系统可以提供一个简便的平台来有效地生产大量单分散的油包水或油包凝胶液滴,对于依赖于高度小型化和体外控制的应用来说非常强大。


参考文献:

[1] Sharma, B. et al. A bulk sub-femtoliter in vitro compartmentalization system using super-fine electrosprays. Sci. Rep. 6, 26257; doi: 10.1038/srep26257 (2016).

[2] Lu, W. C. & Ellington, A. D. In vitro selection of proteins via emulsion compartments. Methods 60, 75–80 (2013).

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[14] Loscertales, I. G. et al. Micro/nano encapsulation via electrified coaxial liquid jets. Science 295, 1695–1698 (2002).

[15] Zhang, Y., Chen, Q., Ge, J. & Liu, Z. Controlled display of enzyme activity with a stretchable hydrogel. Chem. Commun. 49,9815–9817 (2013).

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